Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit
Cat #:GK3603-20T/GK3603-50T
一、试剂盒组成、规格、储存:
成分 20T 50T 储存
AnnexinV-FITC 100μl 250μl -20℃避光保存
Propidium Iodide 100μl 250μl 4℃避光保存
Binding Buffer 10ml 25ml 4℃保存
二、产品简介:
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细
胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为 35~36kD 的 Ca 2+ 依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝
氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜
结合。因此 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行
荧光素 FITC 标记,以标记了的 Annexin V 作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细
胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,
但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将
Annexin V 与 PI 匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)
是用FITC 标记重组人 Annexin V 来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷脂酰丝氨
酸的一种细胞凋亡试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备
进行检测。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测(不推荐用于检测组织样本)。
三、自备试剂及仪器
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器、1.5m L Microtube、载玻
片、盖玻片(荧光显微镜观察需用)、PBS、不含 EDTA 的胰酶消化液。
四、使用方法(仅供参考):
1、悬浮细胞离心(2000rpm 离心 5min)收集;贴壁细胞用不含 EDTA 的胰酶消化
收集(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性);
2、用 PBS 洗涤细胞二次(2000rpm 离心 5min)收集 1~5×10 5 细胞;
3、加入 500μL 的 Binding Buffer 悬浮细胞;
4、加入 5μL Annexin V-FITC 混匀后,加入 5μL Propidium Iodide,混匀;
5、室温、避光、反应 5~15min;
6、请在 1h 内,进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
A.荧光显微镜观察
1、滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞;
2、对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;
(1)将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;
(2)用 PBS 洗涤细胞两次;
(3)在 500μL 的 Binding Buffer 中加入 5μL Annexin V-FITC,5μL Propidium
Iodide,混匀;
(4)将上述溶液滴加于盖玻片表面,使盖玻片表面均匀覆盖;
(5)避光、室温反应 5 min。
(6)将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下、双色滤光片(FITC 和罗丹明)观
察。Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色,PI 荧光信号呈红色。
B.流式细胞仪分析
1、用流式细胞仪检测,激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=530 nm。
2、Annexin V-FITC 的绿色荧光通过 FITC 通道(FL1)检测;PI 红色荧光(流式
Ex=488nm,Em≥630nm)通过 FL2 或 FL3 通道检测,建议使用 FL3。
3、荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节
去除光谱重叠和设定十字门的位置。
五、储存条件
1、Annexin V-FITC组份建议按需分装小份冻存于-20℃,避免反复冻融;
2、Propidium Iodide和Binding Buffer组份不用时可放置于4℃保存,Propidium Iodide
需要避光;
3、一年有效。
六、注意事项
1、AnnexinV-FITC、Propidium Iodide 取用前请低速离心。
2、本试剂盒适用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不以应低于 1×10 5 ,
不推荐用于检测组织样本。
3、推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞,需用不含 EDTA 的胰酶消化,如消化
不当,可能引起假阳性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,而影响检测。可将
胰酶消化后细胞的保存在含 2%BSA 的 PBS 中,防止进一步的损伤。
4、细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品。
5、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同,因而流式检测的荧
光补偿也不同,因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照,
进行荧光补偿的调节。
4、PI 对人体有刺激性,请注意适当防护。
5、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
七、实验范例
附:细胞培养常用试剂
编号 名称 规格
GR3101-500ML 1640 medium 培养液 500ml
GD3103-500ML DMEM,high glucose 高糖培养液 500ml
GH3106-500ML D-Hank’s 液(不含 Ca2+ Mg2+ 含酚红) 500ml
GH3116-500ML D-Hank’s 液(不含 Ca2+ Mg2+ 不含酚红) 500ml
GH3107-500ML Hank’s 液(含 Ca2+ Mg2+ 含酚红) 500ml
GH3117-500ML Hank’s 液(含 Ca2+ Mg2+ 不含酚红) 500ml
GP3108-100ML 0.25%胰蛋白酶消化液(含 EDTA) 100ml
GP3109-100ML 0.25%胰蛋白酶消化液(不含 EDTA) 100ml
GA3502-100ML 青链霉素混合液(100×) 100ml
GP3302-500ML D-PBS 500ml
GS3303-100ML 碳酸氢钠溶液 100ml
GG3304-10ML L-谷氨酰胺(100×) 10ml
GH3301-10ML HEPES 溶液(1mol/L) 10ml
GC3305-50ML 细胞冻存液 50ml
GK3601-50T 细胞凋亡与周期检测试剂盒 (单染) 50T
GK3603-20T 细胞凋亡-Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒(双染) 20T
GK3603-50T 细胞凋亡-Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒(双染) 50T
GK3605-500T MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 500T
GK3607-500T CCK-8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 500T
GC3310-100ML 流式细胞保存液 100ml