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1. 将HRP标记的抗体孵育结束后的蛋白印迹膜漂洗干净。
2. 将ECL-A液和ECL-B液按等体积的比例混匀，即得到ECL工作液（现配现用），每5cm x 8cm的印迹膜约需要3-5 ml ECL工作液。
注：吸取A液和B液的吸头一定要分开。
3. 将印迹膜表面的液体在吸水纸上吸干，平铺在塑料膜上。
4. 将配好的ECL工作液均匀的滴在印迹膜表面，反应2分钟左右后，去除ECL工作液。
5. 将印迹膜夹在两层塑料膜之间，进行X光压片或者放入发光成像仪内拍照。

注意事项:

1.勿将超敏ECL化学发光工作液暴露在阳光或强光下,否则会导致其失活。建议将工作液保存在棕色瓶中,并避免长时间暴露在阳光下,实验室光照对工作液影响不大。
2.使用生物素/亲和素体系时,避免使用脱脂奶粉作为封闭液,因为脱脂奶粉中含有多种内源性生物素,容易产生非特异性信号。
3.使用充足的洗涤缓冲液、封闭液、抗体稀释液和底物工作液去覆盖印迹膜,以确保印迹膜处于湿润状态。使用大量的封闭液和洗涤液能减少非特异性信号的产生。
4.叠氮钠是HRP酶的抑制剂,会对反应体系产生干扰,因此缓冲液中应避免使用叠氮钠做为防腐剂。
5.印迹膜与ECL化学发光工作液孵育后5-30min内的发出的荧光是最强的,随后荧光会随着时间的延长减弱。蛋白点荧光较弱时可以适当延长曝光时间。