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JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒
t Cat #:GK3610
一、试剂盒组成、规格、储存：
成分 ＞ 100T 储存
JC-1(200×) 500ul -20℃
超纯水 90ml 4℃或-20℃
JC-1 染色缓冲液（5×） 80ml 4℃或-20℃
CCCP（10mM） 20ul -20℃
二、产品简介：
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) (Mitochondrial membrane potential assay kit with
JC-1)是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位
变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ∆Ψ m
的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较
高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色
荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体
(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测
线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到
绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧
光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物
(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。实际观察时，使用
常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。
本试剂盒提供了CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。
对于六孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品；对于12孔中的样品，本
试剂盒共可以检测200个样品。
三 、 注意事项
1、JC-1(200×)在 4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管
盖内，可以 20-25℃水浴温育片刻至全部溶解后使用。
2、必须先把 JC-1(200×)用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后，才可以加入 JC-1
染色缓冲液(5×)。不可先配制JC-1染色缓冲液(1×)再加入JC-1(200×)，这样JC-1
会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。
3、装载完 JC-1 后用 JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤时，使 JC-1 染色缓冲液(1×)保持 4
℃左右，此时的洗涤效果较好。
4、JC-1 探针装载完并洗涤后尽量在 30min 内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
5、请勿把 JC-1 染色缓冲液(5X)全部配制成 JC-1 染色缓冲液(1X)，本试剂盒使用过
程中需直接使用 JC-1 染色缓冲液(5X)。
6、如果发现 JC-1 染色缓冲液(5×)中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶
解可以在 37℃加热。
7、CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。
8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
四、保存条件：
-20℃避光保存，并尽量避免反复冻融，有效期一年。
超纯水和 JC-1 染色缓冲液(5×)也可 4℃保存。
五 、使用方法（仅供参考）：
1 JC-1 染色工作液的配制：
六孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为 1ml，其它培养器皿的 JC-1 染色工作液
的用量以此类推；对于细胞悬液每 50-100 万细胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。取适量
JC-1(200×)，按照每 50μl JC-1(200×)加入 8ml 超纯水的比例稀释 JC-1。剧烈振荡
充分溶解并混匀 JC-1。然后再加入 2ml JC-1 染色缓冲液(5×)，混匀后即为 JC-1 染色
工作液。
阳性对照的设置：
把试剂盒中提供的 CCCP(10mM)推荐按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中，
稀释至 10μM，处理细胞 20 分钟。随后按照下述方法装载 JC-1，进行线粒体膜电位
的检测。对于大多数细胞，通常 10μM CCCP 处理 20 分钟后线粒体的膜电位会完全
丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经 JC-1 染色后应显示红色荧光 。
对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献
资料确定。
对于悬浮细胞：
1、取 10-60 万细胞，重悬于 0.5ml 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
2、加入 0.5ml JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。
3、在孵育期间，按照每 1ml JC-1 染色缓冲液(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适
量的 JC-1 染色缓冲液(1×)，并放置于冰浴。
4、37℃孵育结束后，600g 4℃离心 3-4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除
细胞。
5、用 JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤 2 次：加入 1ml JC-1 染色缓冲液(1×X)重悬细胞 ，
600g 4℃离心 3-4 分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入 1ml JC-1 染色缓冲液(1×)重
悬细胞，600g 4℃离心 3-4min，沉淀细胞，弃上清。
6、再用适量 JC-1 染色缓冲液(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察 ，
也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
对于贴壁细胞：
注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收
集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
1、对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适
当溶液洗涤细胞一次，加入 1ml 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
2、加入 1ml JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 分钟。
3、在孵育期间，按照每 1ml JC-1 染色缓冲液(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适
量的 JC-1 染色缓冲液(1×)，并放置于冰浴。
4、37℃孵育结束后， 吸除上清，用 JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤 2 次。
5、加入 2ml 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
6、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
对于纯化的线粒体：
1、把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色缓冲液(1×)稀释 5 倍。
2、0.9ml JC-1 染色工作液（5 倍稀释）中加入 0.1ml 总蛋白量为 10-100μg 纯化的线
粒体。
3、用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫
描(time scan)，激发波长为 485nm，发射波长为 590nm。如果使用荧光酶标仪，
激发波长不能设置为 485nm 时，可以在 475-520nm 范围内设置激发波长。另外 ，
也可以参考下面步骤 6 中的波长设置进行荧光检测。
4、用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。
荧光观测和结果分析：
检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为 490nm，发射光设置为 530nm；检测 JC-1
聚合物时，可以把激发光设置为 525nm，发射光设置为 590nm。注意：此处测定荧
光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微
镜观察，检测 JC-1 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察 GFP 或 FITC
时的设置；检测 JC-1 聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 时的
设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期 。
出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
